Reliability of nucleic acid amplification techniques
L.F.F. Kox, I.L.A. Boxman, C.C.C. Jansen, J.W. Roenhorst
Plantenziektenkundige Dienst, P.O. Box 9102, 6700 HC Wageningen, The Netherlands
Techniques based on nucleic acid amplification have been successfully employed for the detection and identification of many harmful and plant-pathogenic organisms. The polymerase chain reaction (PCR) is the technique most widely used so far. Moreover, fluorescent detection of PCR products in real-time PCR assays makes the technique more suitable for automation and routine testing.
Nucleic acid amplification techniques like PCR enable the detection of very small amounts of target organisms by specific amplification of part of its genome. This exquisite sensitivity puts a high demand on measures to prevent false-positive reactions due to contamination of the laboratory with nucleic acid. Therefore, monitoring of false-positives by the inclusion of negative controls is required. In addition, the performance of the reactions must be measured by the inclusion of several positive controls, e.g. cytochrome oxidase (COX) primers (and probe) to monitor efficiency of the nucleic acid extraction and an internal control to monitor inhibition of the target PCR.
For the real-time reverse transcriptase (RT)-PCR assay for Potato spindle tuber viroid (PSTVd) (Boonham et al., 2004) we developed an exogenic internal standard.This internal standard is in vitro RNA transcribed from a plasmid containing a modified PSTVd sequence: a 17-bp sequence of cloned PSTVd (isolate Howell) was substituted for a 118-bp sequence of Eschericia coli. To this exogenous sequence a specific probe was designed with a fluorescent label different from that of the PSTVd-specific probe. By making use of the same primers as the target organism PSTVd, this internal standard provides a tool to measure the performance of the specific reaction. Moreover, by using another fluorescent probe, this standard can be easily discriminated from the target organism.
Finally, the approach used for the construction of the internal control for PSTVd offers a tool for the construction of internal standards for other pathogens.
N. Boonham, L. González Pérez, M.S. Mendez, E. Lilia Peralta, A. Blockley, K. Walsh, I. Barker & R.A. Mumford. (2004). Development of a real-time RT-PCR assay for the detection of Potato spindle tuber viroid (PSTVd). Journal of Virological Methods 116: 139-146.
Fiabilité des techniques d’amplification de l’acide nucléique
Les techniques basées sur l’amplification de l’acide nucléique ont été employées avec succès pour la détection et l’identification de nombreux organismes phytopathogènes nuisibles. La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est la technique la plus utilisée jusqu’à présent. De plus, la détection à l'aide de sondes fluorescentes des produits de la PCR dans les analyses PCR en temps réel rend la technique plus adaptée à l’automatisation et aux tests de routine.
Les techniques d’amplification de l’acide nucléique comme la PCR permettent la détection de très faibles quantités d’organismes cibles par amplification spécifique d’une partie de son génome. Cette sensibilité aiguë pousse à chercher des mesures pour éviter des résultats faux-positifs à cause de la contamination du laboratoire par de l’acide nucléique. Par conséquent, le suivi des faux-positifs par l’inclusion de témoins négatifs est nécessaire. De plus, la performance des réactions doit être mesurée par l’inclusion de plusieurs témoins positifs, par ex. les amorces (et la sonde) de la cytochrome oxydase (COX) pour suivre l’efficacité de l’extraction de l’acide nucléique et un contrôle interne pour suivre l’inhibition de la cible PCR.
Pour l’analyse (RT)-PCR en temps réel pour le Potato spindle tuber viroid (PSTVd) (Boonham et al., 2004) nous avons développé un témoin interne exogène. Ce témoin interne est un ARN transcrit in vitro à partir d’un plasmide contenant une séquence modifiée du PSTVd: une séquence de 17-bp de PSTVd cloné (isolat Howell) a été substitué par une séquence de 118-bp d’Eschericia coli. Pour cette séquence exogène, une amorce spécifique a été élaborée avec un marquage fluorescent différent de celui de l’amorce spécifique du PSTVd. En utilisant les mêmes amorces que l’organisme cible, le PSTVd, ce témoin interne fournit un outil pour mesurer la performance de la réaction spécifique. De plus, en utilisant une autre amorce fluorescente, ce témoin peut facilement être distingué de l’organisme cible.
Enfin, l’approche utilisée pour la construction du témoin interne pour le PSTVd offre un outil pour la construction de témoins internes pour d’autres pathogènes.