Optimized Protocol

Cell Line Nucleofector Kit R

For HeLa Cells

Product description

Cat. No.

Kit components

Size

Storage and stability

Cell type

Origin

Morphology

Optimal

Nucleofector program

Example for nucleofection of

HeLa cells with H-2KkcDNA.

HeLa cells were nucleofected usingthe NucleofectorKit R for cell linesand a plasmid encoding the mouseMHC class I heavy chain moleculeH-2Kk. 24 hours post-nucleofection,

the cells were stained with a

Cy5-coupled antibody directed againstH-2Kkand were analyzed by flowcytometry. HeLa cells were gatedaccording to forward/side scatter (A).Dead cells were excluded by stainingwith propidium iodide and gating (B).

H-2Kkexpression is shown after

nucleofection without (C) and withplasmid DNA (D).

VCA-1001

2.25 ㎖ Nucleofector Solution R for cell lines

0.5 ㎖ Supplement

25 certified cuvettes

25 plastic pipettes

25 reactions

Nucleofector용액과 Supplement는 4℃에서 보관한다. 유효기간은 용액의 상자에 표시되어 있다.

Human cervix carcinoma (HeLa) [e.g. DSMZ-Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Cat. No. ACC57]

Epitheloid cells in Monolayers.

A-28

For HeLa Cells

Cell culture

Medium

Trypsin treatment

Culture condition

Passage interval

Seeding conditions

Protocol

Culture conditions

before nucleofection

Preparation of the

Nucleofector Solution

GlutaMAX [Invitrogen/Life Technologies, Cat. No. 35050-038]와 10% FCS 함유한 90% MEM(Minimum Essential Medium with Earle’s salts)

0.5 ㎎/㎖ Trypsin; 0.2 ㎎/㎖ EDTA in PBS

일주일에 2, 3회 배지 교체 (2~3 ㎖/25 ㎠ flask).

70 % 가량 자랐을 때 세포를 분주해야 한다.

6~7  104 cell / 25 ㎠ flask.

› Nucleofection을 하기 1일 전에 세포를 분주하는 것이 좋다.

› Nucleofection 하기 위해서 세포는 70 % 가량 자라야 한다.

›0.5 ㎖의 시료를 2.25 ㎖의 Nucleofector 용액에 혼합하여 가볍게 섞어준다. Nucleofector 용액은 바로 사용할 수 있도록 되어 있고 4℃에서 3달간 안정하게 보관할 수 있다. Vial에 표시된 날짜를 반드시 확인하여야 한다.

For HeLa Cells

Nucleofection protocol:

일회 실험을 위한 nucleofection sample 내에 포함될 함유물:

› 0.5~1  106 cells*

› 1~5 ㎍ plasmid DNA (in 1~5 ㎕ H2O or TE)

› 100 ㎕ Nucleofector Solution R

* 하나의 nucleofection sample에 필요한 최소한의 세포수는 5  105 cells 이다. (세포수가 이보다 적으면 세포괴멸을 초래한다.)

1. 필요한 만큼의 세포를 배양한다.

2. 각 sample당 DNA (in 1 ~ 5 ㎕ H2O or TE)를 1~5 ㎍ 준비한다.

3. 공급된 Nucleofector R 용액을 실온이 되도록 보관 냉장고에서 꺼내둔다. 배양액을 37℃로 따뜻하게 하여 50 ㎖ tube에 분주한다. (Sample 당 500 ㎕)

4. 6-well plates에 필요한 수 만큼의 well에 Serum과 supplements를 포함하고 있는 배양액을 1 ㎖씩 채운 다음 37℃/5 % CO2incubator에 미리 넣어둔다.

5. 세포를 배양중인 culture dish에서 배양액을 제거한다. PBS로 한 번 씻어내고 PBS를 빨아내어 버린다.

6. Trypsin/EDTA로 세포를 떼어내고 Serum과 supplements를 포함하고 있는 배양액이나 PBS/0.5 % BSA로 trypsinization을 중지 시킨다. (Nucleofector 사용설명서의 3.5.1 참조)

7. Trypsin으로 처리한 세포 부유액을 분주하여 counting하여 cell density를 측정한다.

8. 필요한 만큼의 세포에 맞게(0.5~1 x 106 cells per nucleofection sample) 덜어서 200 g로 10분간 원심분리 한 다음 상층액을 완전히 제거하여 남은 배양액이 cell pellet을 덮지 않도록 한다.

9. 실온 상태의 Nucleofector용액으로 pellet을 다시 풀어주는데 최종 농도가 0.5~1 x 106 cells/100 ㎕가 되도록 조절한다. 세포 부유액을 실온에서 15분 이상 방치하지 않도록 한다. 장시간 방치하면 세포의 생존율과 transfection 효율이 떨어진다.

중요사항: 10번에서부터 14번 과정은 각 sample을 분리하여 진행해야 한다.

For HeLa Cells

10. 100 ㎕의 세포 부유액을 1~5 ㎍의 DNA (in 1~5 ㎕ H2O or TE)와 혼합한다.

11. 준비된 sample을 공인된 amaxa의 cuvette에 옮긴다. Sample이 cuvette의 바닥을 완전히 덮고 있는지 확인하여 pipetting 하는 동안 공기방울이 생기지 않도록 한다. Cuvette을 파란색 뚜껑으로 닫는다.

12. Cuvette을 cuvette holder에 장착하고 회전 고리를 시계방향으로 돌려 cuvette이 최종 위치로 가게 한다. Program A-28을 선택한다. (Nucleofector Manual, section 2.5 참조) “X” 버튼을 눌러 program을 가동 시킨다.

13. 세포에 미치는 손상을 없애기 위해 program이 끝나면 (“OK” 표시) 즉시 세포를 cuvette에서 덜어낸다. Cuvette을 holder에서 꺼낸다. Cuvette에서 세포를 옮기려면 세포의 손상이나 손실을 막기 위해 kit에 들어있는 plastic pipetes를 사용하는 것이 좋다. 미리 준비해둔serum과 supplements를 포함하고 있는 배양액을 500 ㎕ 보충하고 incubator에 준비해둔 6-well plates로 옮긴다. 아니면 sample을 1.5 ㎖ microcentrifuge tube로 옮겨 37℃ heat block에 올려 놓는다.

14. Nucleofector을 reset 시키려면 아무 key나 누르면 된다.

15. 다른 sample은 10~14 과정을 반복한다.

16. 1.5 ㎖ microcentrifuge tube에서 배양을 했다면 모든 samples을 준비해둔 6-well plates에 옮겨준다.

17. 위의 과정이 끝난 세포는 37℃/5 % CO2incubator에서 배양한다. Transfection 후에 gene expression은 경과 시간에 따라 분석할 수 있다. Gene에 따라 다르지만 보통 4~8 시간 후에 expression을 분석할 수 있다. 경우에 따라서 배양 시간이 24 시간까지 길어질 수 있다.

› Technical Service (Guava Technologies Inc.) DCR-1001

› phone +49 (0)221 - 99199-400 Vs. 01-2002

› e-mail › page 1of 4

›

›기술지원 (영인과학)

› phone (02) 519 – 7345

› e-mail

›